Die EGFR-PUMA-Wechselwirkung ist unabhängig von der ligandenvermittelten Rezeptoraktivierung und wird unter EGFR-Hemmung aufrechterhalten. (A) Die EGFR-PUMA-Wechselwirkung erfolgt unabhängig von der ligandenvermittelten Rezeptoraktivierung. U87MG-EGFR-Zellen wurden 24 Stunden lang an Serum gehungert und 20 Minuten lang mit EGF stimuliert. Die Zellen wurden geerntet und Puma Damen Sneaker einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechtes Feld) unterzogen. Ein EGFR-Antikörper wurde verwendet, um EGFR zu immunpräzipitieren.
Kontroll-IgG ergab keine Signale, die auf Spezifität hinweisen. Der autophosphorylierte Y1068-Rest dient als Indikator für die Puma De EGF-induzierte EGFR-Aktivierung. (B) EGFR-Kinaseaktivität ist für ihre Wechselwirkung mit PUMA nicht erforderlich. U87MG-EGFR-Zellen, die 2 Stunden lang mit und ohne Iressa (25 uM) behandelt wurden, wurden einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechtes Feld) unterzogen. Kontroll-IgG ergab keine Signale, die auf Spezifität hinweisen.
Iressa-Behandlungen hemmten wirksam die EGFR-Kinaseaktivität, beeinflussten jedoch die Wechselwirkung zwischen EGFR / EGFRvIII und PUMA nicht signifikant, was darauf hinweist, dass die Wechselwirkung keine EGFR-Kinaseaktivität erforderte. (C) Puma Disc Die anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-xL sind in den meisten GBM-Zelllinien stark exprimiert. Western Blot wurde durchgeführt, um die Expressionsniveaus für anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2-Proteinfamilie zu bestimmen. Bemerkenswerterweise sind Bcl-2 und Bcl-xL in der Mehrzahl der analysierten GBM-Zelllinien stark exprimiert, nicht jedoch in Mcl-1. (D) Die Wiederherstellung der intrinsischen Apoptose sensibilisiert EGFR / EGFRvIII-exprimierende GBM-Zellen für eine EGFR-gezielte Therapie.
Die Behandlungssynergie wird durch CI-Werte von weniger als 1,0 angezeigt; additive Wirkung, CI = 1,0; antagonistische Wirkung, CI> 1,0. Wie in 6d gezeigt, führte die Kombination des EGFR-Inhibitors (Iressa) mit dem Bcl-2 / Bcl-xL-Inhibitor (2-MA A3) zu einer synergistischen Zellabtötung sowohl in U87MG-EGFR- als auch in U87MG-EGFRvIII-Zelllinien. Diese Ergebnisse zeigen, dass die gleichzeitige Hemmung der kinaseunabhängigen Funktion von EGFR / EGFRvIII Puma Evospeed unter Verwendung eines Bcl-2 / Bcl-xL-Inhibitors und der kinaseabhängigen Aktivität durch EGFR-Kinase-Inhibitoren zu synergistischen therapeutischen Wirkungen in GBM-Zellen führen kann.
Diese Ergebnisse erlauben die Spekulation, dass eine Untergruppe von GBMs (34%) in der Lage ist, die EGFR / EGFRvIII-Expression hoch zu regulieren, um PUMA negativ zu regulieren und dadurch der therapieinduzierten Apoptose zu entgehen. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch auch, dass PUMA durch EGFR / EGFRvIII-unabhängige Mechanismen negativ reguliert werden kann, da (2a) ein Teil der PUMA-exprimierenden GBMs kein EGFR / EGFRvIII exprimiert. Zukünftige Untersuchungen sind daher erforderlich, um diese Mechanismen
zu identifizieren und die apoptotischen Wirkungen der Anti-GBM-Therapie zu verstärken.